2018年10月份陈列平教授在 Cell 上发表了一篇题为A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy： From Enhancement to Normalization的综述，提出并强调了“免疫正常化”的概念。

文章指出，近年来，肿瘤免疫治疗经历了一个范式转变，从系统性提高免疫反应活性的免疫增强（immune enhancement）转变到选择性纠正肿瘤微环境中免疫缺陷的免疫正常化（immune normalization）。免疫正常化的概念强调了在肿瘤进展过程中识别免疫反应的特定缺陷或功能异常的重要性，并制定特定策略纠正这些缺陷，以恢复体内正常的抗肿瘤免疫能力。免疫正常化通过解除受阻断的免疫反应来增加体内抗肿瘤反应，而免疫增强的目的是激活免疫系统来提高抗肿瘤反应。我们可以将免疫反应过程看作是一条有水流的管道。在这种情况下，正常的免疫反应就是管道有正常通畅的水流。如果管道堵塞，水流将受到影响，管道将无法充分排水。在这种情况下，“增强”策略可以解释为增加管道内压力，以克服排水不足，但如果管内压力增加太多，则会有破坏管道的相关风险。相反，“正常化”策略则会通过识别并解除阻塞以恢复正常引流，且不会危及管壁（图1）。

那如何识别找到“水流中的阻塞”，即免疫正常化策略中的靶标呢？

陈列平教授提出了三点标准：（1）该靶标是由于肿瘤的生长和/或随后的免疫监视而诱导的；（2）其在肿瘤微环境中选择性高表达而正常组织中有较低的表达量；（3）其能够引起免疫逃避，并且操纵其可以重置或重编程肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫。有了这些特点，肿瘤免疫疗法可以避免过度的自身免疫毒性而取得相当大的治疗效果。陈列平教授团队使用这一严格的标准来鉴定新的免疫调节分子，特别是在B7-H1（PD-L1）阴性的肿瘤中，找到了不少免疫治疗新靶标。2018年12月，其团队就曾在Cell上发表题为Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3的论文，证明了纤维介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1， FGL1)是LAG-3的一个重要的功能性配体，并揭示了该LAG-3-FGL1通路在肿瘤免疫中的作用（详见BioArt：Cell亮点丨陈列平团队发现肿瘤免疫逃逸新通路）。

2019年3月4，耶鲁大学陈列平教授团队（第一作者为王俊博士）在Nature Medicine上发表题为Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy的文章，鉴定并证明了又一个分子——Siglec-15是一免疫抑制分子，并可作为正常化免疫治疗的潜在靶标。

该团队构建了一个高通量功能筛选系统（genome-scale T cell activity array， TCAA），以在体外识别调节T细胞活性的细胞表面分子（图2）。

TCAA包含超过6500个人类基因，编码人类基因组中超过90%的跨膜蛋白，单个基因在阵列中短暂表达。他们设计了一种基于293T细胞的人工抗原呈递细胞系（aAPC），该细胞系表达一种用于T细胞受体激活的膜相关抗人CD3（OKT3）单链可变片段（scFv），以及一些跨膜信号转导基因（DAP10、DAP12、FCER1G和CD3Z）以促进膜蛋白表达【1】。研究者使用Jurkat T细胞来检测靶基因的功能及其对T细胞活性的影响，Jurkat T细胞中稳定表达了一个由NF-κB或NFAT反应元件驱动的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein， GFP）报告基因。这样通过与空白对照组对比，就可以利用GFP信号强弱来鉴定aAPC上表达的膜蛋白对T细胞活性的影响。持续抑制或增强GFP信号的基因在多轮TCAA筛选后被选择，随后在体内和体外进行综合分析。在这些候选基因中，一些是已经被报道的共刺激分子（B7-1， B7-2， CD200， CD70），凋亡相关基因（FASL， TRAIL， GZMB）或共抑制分子（KLRD1， BTN3A3等等），这也验证了TCAA系统的准确性。

通过TCAA系统筛选，研究团队发现Siglec-15可持续地抑制T细胞活性，并有可能满足正常化免疫治疗的主要特征【2】，因此被选择以进行后续研究。Siglec-15是一个唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族（Siglec family）基因，编码一个非常短的胞外结构域（ECD）【3】。蛋白质序列分析显示，Siglec-15 ECD包含一个免疫球蛋白可变区（IgV）和一个2型恒定区（IgC2），与B7基因家族具有30%以上的相似性。这些数据表明，Siglec-15与B7基因家族关系密切，可能与B7家族成员共享免疫调节功能。

随后研究团队发现，在大多数正常人体组织和各种免疫细胞亚群中Siglec-15mRNA的表达很少，但可以在巨噬细胞中发现。通过流式细胞术，研究人员发现Siglec-15在小鼠CD11b + F4/80 +外周巨噬细胞，新鲜骨髓来源的CD11b + Gr-1 +髓系细胞和骨髓来源的CD11b + F4/80 +巨噬细胞（BMDMs）中有低水平的表达量，但在其他淋巴细胞和髓系细胞亚群中未检测到其表达。利用Siglec-15全身基因敲除小鼠以及在巨噬细胞中条件性敲除Siglec-15小鼠模型，研究人员发现Siglec-15基因敲出并不会导致小鼠自身免疫疾病或其他症状，之后进行一系列体内体外实验，证明了巨噬细胞/髓系来源的Siglec-15可以通过调节细胞生长来抑制抗原特异性T细胞的免疫应答。

然后，通过TCGA数据库的Meta分析，研究团队发现，在人多种肿瘤中，Siglec-15mRNA表达量都上调。在241个人非小细胞肺癌NSCLC样本中，通过免疫组化分析，研究人员发现Siglec-15可以在肿瘤相关的基质细胞或肿瘤细胞，以及肿瘤浸润的巨噬/髓系细胞上检测到。同时发现B7-H1（PD-L1）和Siglec-15表达之间没有相关性（r=0.035，p=0.60），只有7/218（3.2%）的病例两个标志物均为阳性。

最后，研究人员利用小鼠肿瘤模型进一步证明了Siglec-15是肿瘤免疫治疗正常化策略的潜在候选者。研究人员将B16-GMCSF肿瘤细胞接种到Siglec-15基因敲除小鼠体内，与野生型小鼠相比肿瘤生长缓慢，基因敲除小鼠生存期延长，同时基因敲除小鼠肿瘤中CD8+T细胞，NK细胞的浸润也增多。此外，研究团队设计了抗Siglec-15单克隆抗体α-S15，将其用在多种小鼠肿瘤模型，发现其的确可以阻断巨噬/髓系细胞来源的Siglec-15的免疫抑制作用来提高体内抗肿瘤免疫反应。

总之，本文鉴定并证明了Siglec-15是一免疫抑制分子，并可作为肿瘤免疫治疗正常化策略的潜在候选者。值得一提的是，文章也表明，目前测试人源化Siglec-15单克隆抗体（NC318）对人实体肿瘤影响的一期临床试验（NC03665285）正在进行。

为了详细了解该工作的重要意义以及后续临床相关信息，BioArt独家联系了陈列平教授。针对该项研究，陈教授简要总结了该发现以及意义。他表示：

“Siglec-15是一新的免疫调节靶点，在肿瘤微环境能抑制免疫反应。Siglec-15在肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞以及在包括肺癌、卵巢癌和头颈癌等在内多种人体肿瘤细胞中的表达上调，且其表达与B7-H1（PD-L1）是互斥的。实验证明，Siglec-15在体外和体内都能抑制抗原特异性T细胞反应。Siglec-15是B7-H1（PD-L1）阴性肿瘤（抗PD治疗对其无效）中的主要免疫抑制因子。我们希望Siglec-15会是一系列免疫治疗新靶点中的第一个，来帮助那些对当前免疫治疗无反应的肿瘤患者。我们研究表明，Siglec-15敲除小鼠没有发生自身免疫病或其他疾病，这表明，Siglec-15的阻断在正常细胞上并不会产生严重的副作用。NC318，是第一个阻断Siglec-15免疫抑制性的新药，对NC318的1/2期临床试验也正在进行。”(生物谷Bioon.com）

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