applied DNA Sciences子公司LineaRx通过专有的非病毒、无质粒平台（non-viral， plasmid-free ；NVPF）在人类CAR-T细胞中实现抗CD19表达，开创新一代更快、更经济的细胞治疗药物。

据该公司所知，这一开创性的事件首次表明人类T细胞利用可扩展PCR（聚合酶链式反应）制造工艺生产的线性DNA从基因构建体表达抗CD19 CAR。该公司将这一进展视为目前所有使用病毒递送平台基因疗法的一个重要选择，尤其是使用病毒传递合成基因来重定向患者T细胞的免疫肿瘤疗法，即CAR疗法。

LineaRx独特的PCR的制造技术创造了编码抗CD19衔接器的线性DNA扩增子，然后将该构建体通过离体电穿孔到人T细胞中，随后的测试显示从这些工程细胞中产生抗CD19表达。虽然这些初步数据令人鼓舞，但总体表达水平最初较低，LineaRx将继续致力于使用正在申请专利的高表达扩增子（HEA？）和除电穿孔以外的转染方法产生更高的转染水平，并将报告这一重大成就的进一步进展。

如立体模式图显示，当细胞通过“电转区”时，施加脉冲，电场线通常不将绝缘的细胞穿透，而是通过导电孔穿过细胞。

目前，电穿孔技术已广泛应用于生物技术、基因工程、临床医学等多个领域。比如，利用电穿孔实现基因转染、细胞融合、将外源蛋白质分子插入细胞膜、激活细胞膜的传输因子、提高酶的活性、提高药物进入细胞的能力、以及增强癌症的化疗效果等。

成功的细胞转染关系到众多生物医学研究以及生物产业链，包括细胞疗法、RNA干扰、以及干细胞研究。非病毒方法的外源载体转染技术面临的主要挑战在于不够稳定的、低下的转化效率，尤其是原代细胞系、干细胞系这类难转株。电穿孔技术的一个传统瓶颈在于，如何以不牺牲细胞生存能力为前提，取得高效的转化率。成功的电转技术涉及了电场、缓冲参数等方方面面的优化，需要考虑到不同的细胞系、分子负载等，以达到转化效率和细胞损伤量的理想平衡。如此而来，一个成功的电转技术的可能经历过反复失败，并且很可能在另外一个实验室或另一项应用中将无法重复。

这一成就建立在另一个第一个工程人类T细胞的基础上，通过线性DNA扩增子在2018年末通过LineaRx的PCR技术生产、设计和制造，证明了一个线性DNA扩增子，其中含有编码绿色荧光蛋白产生的完整基因（GFP），如在显微镜图像中所见，通过高通量电穿孔促进了PCR产生的GFP基因片段在数百个人T细胞中的摄取和随后表达，产生了绿色荧光细胞的亮点。

LineaRx认为NVPF CAR-T制造平台比现有的基于病毒/质粒的CAR-T平台具有许多潜在优势，包括：

简化的生产流程将降低成本和缩短交货时间，通过缩短“静脉对静脉”的时间减少病人的发病率和死亡率。

降低永久性遗传整合/重组进入靶细胞的风险，降低插入诱变的风险

目前一些CAR-T细胞治疗副作用的潜在缓解，如细胞因子释放综合征（CRS）和靶向肿瘤外毒性

靶向新抗原的最终能力（足以快速影响患者）或个体患者癌症中产生的特异性蛋白质突变，以及癌症以外的其他疾病表现，这将使患者的免疫系统成为多种治疗手段的工具

最终能够在护理点开发CAR-T疗法，避免复杂和繁琐的供应链，从而加速治疗

applied DNA总裁兼首席执行官James A. Hayward博士表示： “我们的目标有三个方面：1）作为快速设计和生产治疗性核酸构建体的平台，建立包括在护理点的PCR产生的线性DNA的价值； 2）证明不同于全行业病毒生产的NVPF生产流程具有更高的安全性和治疗价值；3)与未来的合作伙伴将我们基于NVPF的抗CD19 CAR T细胞治疗带到临床。”

2018年10月，LineaRx宣布与iCell基因治疗公司签署了一项北美独家授权和研究服务协议，用于抗CD19 CAR-T治疗的研究。LineaRx利用applied DNA在大规模PCR生产和DNA化学修饰方面的专长及其NVPF平台开发和生产CAR-T治疗的表达载体，包括其非病毒、无质粒抗CD19 CAR-T候选药物LinCART19？。

在不使用病毒载体或质粒的情况下，LineaRx的NVPF制造平台与现有的基于病毒/质粒的CAR-T方法相比具有许多潜在优势，若成功则可以为患者提供了更高效，更实惠和更安全的基因疗法。

目前，这些初步数据令人鼓舞，但总体表达水平最初较低，LineaRx将继续致力于使用正在申请专利的高表达扩增子（HEA？）和除电穿孔以外的转染方法产生更高的转染水平，并将报告这一重大成就的进一步进展。

未来，该公司是否能实现比现有的基于病毒/质粒的CAR-T平台的潜在优势，我们拭目以待！(生物谷Bioon.com）

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