2020-06-19至2020-07-31 线上
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CRISPR-Cas9为突破工程化细胞活性扫除障碍

来源:新康界

多数癌症可被免疫系统识别并攻击,但是因为肿瘤介导的免疫抑制和免疫逃逸机制而进展不一。输注体外工程化T细胞,即T细胞过继疗法(adoptedT cell therapy),能增加患者的天然抗肿瘤免疫反应。基因疗法重定向免疫特异性与基因编辑相结合具有改善疗效并增加工程化T细胞安全性的潜力。CRISPR与Cas9(CRISPR相关蛋白9)偶联核酸内切酶是一项强有力的基因编辑技术,具有靶向T细胞中多个基因来改善肿瘤免疫疗法的能力。

工程化T细胞疗法给癌症治疗带来了革命性的变化,在血液相关癌症,如白血病和淋巴瘤的治疗过程中获得了长期持续的缓解。该疗法涉及取出患者T细胞,“重新编辑”使其攻击癌细胞,然后再将它们转移回患者。使用CRISPR-Cas9的靶基因灭活(敲除)能增强T细胞活性,并且有扩增细胞疗法应用的潜力。然而直到现在,仍然不知CRISPR-Cas9编辑T细胞在回输人体后能否耐受并增殖。Stadtmauer等人发表了I期临床试验(NCT03399448)晚期难治性癌症患者接受CRISPR-Cas9修饰T细胞治疗的数据,他们将这种细胞称为CRISPR-Cas9 NYCE T细胞。结果显示了基因编辑的治疗性应用的一项重要进展,并突出了加速开发细胞疗法的潜力。

工程化细胞疗法的生产涉及用脱毒病毒转导分离出的患者T细胞,使其通过表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CARs)识别呈现在癌细胞表面的抗原,或者通过表达T细胞受体(Tcell receptors, TCRs)识别癌细胞内的癌症相关多肽抗原。转导后,工程化T细胞数量被扩增,然后回输病人体内。虽然对治疗一些类型的癌症高度有效,工程化T细胞活性的特异性和寿命可被改善。例如,T细胞活性通过PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)受体被天然下调。系统性抑制患者的PD-1能增强T细胞活性,但经常诱发不良自体免疫反应。此外,内源性的TCR表达与工程化T细胞的转基因受体竞争,干扰信号传递或细胞转运。敲除TCR基因和编码PD-1的PDCD1基因在临床前人肿瘤异种移植小鼠模型中能增强工程化人体T细胞活性。上文提到,Stadtmauer等测试了CRISPR-Cas9敲除这些基因的患者衍生T细胞在回输人体后是否安全和持久。

一项试验入组了六名骨髓瘤或肉瘤患者,其中三名满足T细胞回输的研究标准。通过两步处理来获得原生TCR和PDCD1基因敲除,以及在工程化细胞中转基因TCR的表达。在第一步,分离出的患者T细胞用预成型的Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)电穿孔,并引导RNA靶向内源性TCR-TCRα(TRAC)、TCRβ(TRBC)及PDCD1,进行基因中断。在第二步,细胞用病毒载体转导以表达转基因TCR,其能识别癌症-睾丸抗原(NY-ESO-1),并且在培养基中扩增以产生NY-ESO-1转导CRISPR 3X编辑细胞(NYCE)细胞。值得一提的是,NYCE细胞消除了表达NY-ESO-1的细胞,比单独表达NY-ESO-1 TCR的T细胞更加有效,符合成功敲除内源性TCR的预期结果。

NYCE细胞成功植入全部患者,并且在回输9个月之后仍可被检测到。未经CRISPR基因编辑的、表达NY-ESO-1 TCR的T细胞在此前的临床试验中输注后的半衰期约为1周。从一名研究参加者重新分离出的NYCE细胞的基因表达特征与中央记忆细胞一致,标志着稳定的移植。此结果与之前的研究形成鲜明对比,表达NY-ESO-1 TCRs的未编辑细胞展示出T细胞耗竭的标记物。CRISPR-Cas9对内源性TCR和PD-1的中断改善了工程化T细胞的细胞杀伤能力并且促进了长期的持续性。

CRISPR-Cas9编辑细胞的人体安全性是必须考虑的重要问题。目前不清楚Cas9编辑的细胞是否将有免疫原性,也不清楚残留的细菌蛋白Cas9是否将会诱发免疫反应。Stadtmauer等报道在三名患者中未观察到NYCE细胞的编辑相关毒性。此外,虽然研究参与者有预先存在的T细胞和Cas9蛋白的特异性抗体,抗体滴定在整个研究过程中未从基线增加。Cas9免疫反应缺失可能归因于接受NYCE细胞患者的免疫抑制,或者是因为Cas9作为一个非病毒、预先形成的RNP递送。与病毒递送导致被治疗细胞持续表达Cas9相比,RNP在细胞中的半衰期有限。Stadtmauer等也报道了CRISPR-Cas9的最小脱靶编辑,不超过1%的NYCE细胞在回输后含有染色体易位减少。这些发现为安全生产和无免疫性给予基因编辑体细胞提供了指南。

现存尚未解答的最大问题是CRISPR编辑的工程化T细胞对于晚期癌症是否有效。关于NYCE细胞的I期试验评估了安全性,但治疗患者的疗效并未评估。在研究末期,一名参与者因癌症进展死亡,另外两名患者接受了其他疗法。虽然Cas9工程化细胞的疗效因此而模糊,此研究受到2016年出台的编辑方案限制。此研究的基因中断效率一般(15到45%),然而现存的方案使用Cas9RNPs在人T细胞中获得超过90%的基因中断。此外,近期工作已证实CAR转基因插入人T细胞TRAC基因,同时导致内源性TCR的敲除,同时通过原生启动子驱动CAR的表达。在产生精准基因修饰及其他癌症相关靶点选择方面的进步,可增强工程化T细胞治疗其他癌症的疗效,包括实体瘤,大部分对工程化细胞疗法的活性具有抗性。

临床证实的CRISPR基因编辑细胞的长期安全性为下一代基于细胞的疗法铺平了道路。虽然其他类型基因编辑体细胞(如干细胞)的安全性仍然待定,但是振奋人心的消息是首批输注CRISPR-Cas9修饰细胞的β地中海贫血和镰状细胞贫血患者显示出健康的血液产生。随着更多的基因标记疗法被证明安全且有效,临床转化的障碍将成为细胞制造和给药。工程化细胞的生产工艺和修饰体内靶细胞的CRISPR-Cas9递送策略亟待重构以减少成本,使这些革命性的疗法惠及能够获益的患者。(生物谷Bioon.com)

 

 

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